1.熒光定量PCR儀擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒(méi)有條帶或條帶很淺
　　·常見(jiàn)的原因在于反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系；
　　·與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)；
　　·建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA；
　　·*鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過(guò)1/10；
　　·目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：
　?、賹?鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。
　　②使用隨機(jī)六聚體代替dT進(jìn)行*鏈反應(yīng)。
　　2.產(chǎn)生非特異性條帶
　　·用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的熒光定量PCR儀測(cè)試結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品；
　　·在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生；
　　·由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。
　　3.產(chǎn)生彌散條帶
　　·在PCR反應(yīng)體系中*鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高；
　　·減少引物的用量；
　　·優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)；
　　·在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。
　　4.產(chǎn)生大分子量的彌散條帶
　　·大多數(shù)情況下是由于退火溫度過(guò)低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的；
　　·對(duì)于長(zhǎng)片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10。